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本期細(xì)胞學(xué)堂為大家整理了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取的方法、注意事項及鑒定指標(biāo)，幫助您快速上手開展實(shí)驗。
分離提取步驟
骨髓取材
將大鼠斷頸處死后, 置于75%醫(yī)用酒精內(nèi)浸泡5~10 min，消毒后將動物轉(zhuǎn)運(yùn)至超凈工作臺內(nèi)。無菌分離雙側(cè)股骨和脛骨，用新的剪刀鑷子清除股骨脛骨周圍肌肉組織；保持骨頭完整，留取純凈骨頭，將組織轉(zhuǎn)移至新的含有PBS的培養(yǎng)皿內(nèi)，剪去骨干的兩端, 暴露骨髓腔；取注射器，吸取培養(yǎng)基，從骨頭一端插針，沖洗骨髓（至骨頭發(fā)白透亮），反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液。
分離方法
BMSCs常見的分離方法有密度梯度離心法、貼壁法以及免疫磁珠分選法，大家可以根據(jù)自己實(shí)驗室條件來選擇合適的分離方法。
1
密度梯度離心法
將裝有大鼠骨髓液的15 mL離心管，1500 rpm離心5 min；棄上清，用完-全培養(yǎng)基重懸沉淀；將培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液緩慢滴加到Percoll分離液（用PBS稀釋）上方，形成密度梯度分離液；2000~2500 rpm離心25 min，吸取中間層的白色霧狀細(xì)胞層，加入PBS清洗細(xì)胞，1800 rpm離心5 min；棄上清，保留細(xì)胞沉淀；用細(xì)胞完-全培養(yǎng)基重懸沉淀，將細(xì)胞懸液按1×106/mL密度接種于T25瓶中，于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。首-次2 d換液，棄去未貼壁細(xì)胞, 此后每2~3 d換液一次；待細(xì)胞融合達(dá)80%后, 用胰酶消化1~2 min后傳代培養(yǎng)。
2
貼壁法
也稱全骨髓培養(yǎng)法或一步法。將收集的骨髓懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后，用完-全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液；培養(yǎng)48 h首-次換液，棄去未貼壁細(xì)胞；此后每2~3 d換液一次，觀察細(xì)胞的生長及融合程度，待細(xì)胞融合80%以上后開始傳代培養(yǎng)。
3
流式細(xì)胞儀或免疫磁珠分選法
免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀分選法通過識別細(xì)胞表面特異性抗原分離細(xì)胞，可獲得純度較高的細(xì)胞，但對細(xì)胞的活性影響較大，獲得的細(xì)胞量少，需要特殊的儀器，實(shí)際應(yīng)用受限。
注意事項
鑒定指標(biāo)
01
細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
剛分離提純的原代細(xì)胞形態(tài)呈圓形，大小不一，漂浮于培養(yǎng)液中（圖1）。經(jīng)純化貼壁后可見，細(xì)胞呈成纖維樣緊密排列，漩渦樣生長，胞核大、清晰、呈長梭形，細(xì)胞形態(tài)趨于統(tǒng)一（圖2），其形態(tài)符合BMSCs 的貼壁形態(tài)。
圖1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞剛分離，呈圓形
圖2 普諾賽實(shí)驗室提純的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
02
表面標(biāo)志物
目前使用較多的是CD90、CD29、CD44等陽性表達(dá)指標(biāo)。
普諾賽實(shí)驗室提取的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD90表達(dá)
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