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細(xì)胞凋亡（Apoptosis），作為一種深入研究的程序性細(xì)胞死亡形式，近年來(lái)已成為生物學(xué)領(lǐng)域的熱門課題。如果你的研究涉及癌癥機(jī)制與療法、藥物篩選與藥理作用、生物發(fā)育、免疫學(xué)或神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域，細(xì)胞凋亡檢測(cè)無(wú)疑是你實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中重要的一環(huán)。
在本期的細(xì)胞學(xué)堂中，我們將深入介紹不同類型凋亡檢測(cè)試劑盒的相關(guān)知識(shí)，并分享一些關(guān)于如何選擇凋亡檢測(cè)試劑盒的經(jīng)驗(yàn)，旨在幫助您輕松理解并為您的樣本選擇合適的凋亡檢測(cè)試劑盒。
凋亡細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)和生理上與壞死細(xì)胞和正常細(xì)胞存在顯著不同，其細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核酸以及凋亡相關(guān)蛋白都發(fā)生明顯變化，具有鮮明特征。這些差異為我們提供了檢測(cè)細(xì)胞凋亡的多種方法。常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法包括形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞膜磷脂外翻檢測(cè)、凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)、DNA斷裂檢測(cè)、細(xì)胞周期分析等。這些方法各有特點(diǎn)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和條件選擇合適的檢測(cè)方法。
根據(jù)細(xì)胞凋亡的機(jī)制和特點(diǎn)，普諾賽®自主研發(fā)了Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒、TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒、Caspase活性檢測(cè)試劑盒和線粒體膜電位(JC-1)檢測(cè)試劑盒。
檢測(cè)原理：Annexin V是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸（PS）有高度親和力。在正常細(xì)胞中，PS通常位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)。然而，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜的通透性會(huì)發(fā)生變化，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的PS部分外翻，暴露到細(xì)胞膜外側(cè)。Annexin V可通過(guò)與凋亡早期細(xì)胞胞外翻的PS結(jié)合，從而識(shí)別凋亡細(xì)胞。為了更便于檢測(cè)，將Annexin V標(biāo)記上熒光染料，可通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡等設(shè)備檢測(cè)到帶有熒光的凋亡細(xì)胞。細(xì)胞核染料（PI、DAPI、7-AAD）可與雙鏈DNA特異性結(jié)合，并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。正常情況下大分子的核染料是無(wú)法透過(guò)細(xì)胞膜，由于凋亡晚期或壞死細(xì)胞膜喪失完整性，細(xì)胞核染料可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)對(duì)DNA進(jìn)行染色，與Annexin V搭配使用，可區(qū)分處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。
檢測(cè)原理：在細(xì)胞凋亡的晚期，染色體DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端。在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，脫氧核糖核苷酸與熒光素等標(biāo)記物形成的衍生物可以被標(biāo)記到斷裂DNA的3'-末端，從而進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。
檢測(cè)原理：Caspase是一個(gè)蛋白酶家族，通常以無(wú)活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。活化的Caspase會(huì)破壞一些重要的胞內(nèi)蛋白，從而引發(fā)凋亡的發(fā)生。將Caspase序列特異性的多肽酶偶聯(lián)至黃色基團(tuán)pNA作為底物，當(dāng)Caspase被活化后，它能夠剪切這個(gè)底物，釋放出游離的黃色基團(tuán)。通過(guò)酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)測(cè)定這些黃色基團(tuán)的吸光值，就可以定量評(píng)估Caspase的活性，從而間接地監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。
檢測(cè)原理：在正常細(xì)胞中，線粒體膜電位通常較高，JC-1主要在線粒體基質(zhì)中聚集，以聚合體的形式存在，可產(chǎn)生紅色熒光。然而，在細(xì)胞凋亡的早期階段，線粒體膜電位會(huì)顯著降低，導(dǎo)致JC-1無(wú)法在線粒體基質(zhì)中積累，主要以單體形式存在，可產(chǎn)生綠色熒光。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，可將JC-1熒光顏色的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的檢測(cè)指標(biāo)。
目前市售的凋亡檢測(cè)試劑盒種類眾多，如何選擇一款匹配自己檢測(cè)樣本和實(shí)驗(yàn)條件的試劑盒至關(guān)重要。以下是兩點(diǎn)可供參考的建議：
01
基于樣本類型選擇
根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣本類型，選擇合適的凋亡檢測(cè)試劑盒。推薦您參考下方表格所示的內(nèi)容，以便為您的樣本類型選擇適當(dāng)?shù)牡蛲鰴z測(cè)試劑盒。例如懸浮細(xì)胞或經(jīng)消化下來(lái)的貼壁細(xì)胞，四種凋亡試劑盒都可考慮使用，這些試劑盒通常能夠適用于不同類型的細(xì)胞樣本。然而，對(duì)于組織樣本，需要注意不同的試劑盒樣本制備方法可能不同。使用TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒時(shí)，需制備石蠟或冷凍切片，而使用Caspase活性檢測(cè)試劑盒時(shí)，則需對(duì)組織進(jìn)行機(jī)械剪碎、勻漿和裂解。
02
基于實(shí)驗(yàn)儀器和配置選擇
不同凋亡檢測(cè)試劑盒的使用需要配備對(duì)應(yīng)的儀器。推薦您參考下方表格，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)儀器，選擇合適的凋亡檢測(cè)試劑盒。需要提醒的是，除了確認(rèn)儀器是否可用，還需要了解實(shí)驗(yàn)儀器的具體配置，例如流式細(xì)胞儀的熒光檢測(cè)通道和熒光顯微鏡的濾光片組等。
市售的Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒和TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒，有多種熒光染料組合可供選擇。在選擇熒光染料時(shí)，需根據(jù)儀器配置選擇能夠檢測(cè)的熒光染料。除此之外，如果您的細(xì)胞自帶熒光（如轉(zhuǎn)染了熒光蛋白的細(xì)胞或使用了帶熒光的藥物處理細(xì)胞），在儀器配置允許的前提下，優(yōu)先選擇與細(xì)胞自發(fā)熒光不同檢測(cè)通道的熒光染料。如果受限于儀器配置條件，無(wú)法避免熒光染料光譜重疊，要注意合理設(shè)置單染管用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
試劑盒種類 | 檢測(cè)樣本 | 檢測(cè)儀器 |
Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒 | 懸浮/貼壁細(xì)胞 | 流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡 |
TUNEL凋亡將測(cè)試劑盒 | 懸浮/貼壁細(xì)胞 | 流式細(xì)胞儀 |
細(xì)胞爬片/涂片、石蠟切片、冷凍切片 | 熒光顯微鏡 | |
Caspase活性檢測(cè)試劑盒 | 細(xì)胞、組織 | 分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀 |
線粒體膜電位（JC-1）檢測(cè)試劑盒 | 懸浮/貼壁細(xì)胞 | 熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀 |
以上是關(guān)于凋亡檢測(cè)試劑盒的知識(shí)科普及選擇指南，更多細(xì)胞培養(yǎng)和檢測(cè)相關(guān)干貨，請(qǐng)持續(xù)關(guān)注細(xì)胞學(xué)堂專欄~
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